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    公开号:WO1991015502A1
    申请号:PCT/JP1991/000421
    申请日:1991-03-29
    公开日:1991-10-17
    发明作者:Toshihiko Kaminuma；Toshii Iida；Masahiro Tajima
    申请人:Shiseido Company, Ltd.；
    IPC主号:C07K1-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 ボリ ベプチ ドの精製方法
    [0002] 〔技術分野〕
    [0003] 本発明は、 ポリペプチ ドの改善された精製方法に関し、 よ り具体的には、 目的ボリ べプチ ド舍有物に一定の前処理を施 した粗製ポリ ペプチ ドの水性溶液を逆相系高速液体ク ロマ ト グラフィ一用充塡剤で処理する精製方法に関する。
    [0004] 〔背景技術〕
    [0005] 微生物、 動物細胞、 植物細胞の生産するボリ ぺプチ ドは、 生理活性を有したまま高純度に精製する際、 非常に繁雑な操 作が必要となり、 コ ス ト、 収率面で改善の余地が残されてい るのが実情である。 例えば、 形質転換微生物により生産され た ヒ ト成長ホルモ ン放出因子は、 その精製に 10段階の操作を 用い、 生産量は多いものの、 収率が低く、 バイ オア ツセィ を 行うには不十分な量であった（Vincent Geli et al. , Gene- 80. 129-136 (1989))。 また、 ヒ ト カルシ ト ニ ンの精製に閬し て 6種類のカ ラ ムを用い、 8段階の精製操作を行い、 カルシ トニンを単離した報告がある（J.P.Gilligan et al. ,
    [0006] Biochroma- tograph , 2 (1) , 20-27 (1987)) 。
    [0007] しかしながら、 これらの精製工程は非常に複雑であり、 精 製中、 ボリ ぺプチ ドの分解、 ポリ ぺプチ ドの生理活性の消失 が考えられる。 したがって本発明は、 これらの問題点を解決するため、 ポ リ ペプチ ドを安定な形で単離することができ、 かつ簡便な操 作を行い、 高収率でポリ ペプチ ドを単離 · 精製するこ とので きる方法を提供することを目的とする。
    [0008] 〔発明の開示〕
    [0009] 近年、 上述のようなヒ ト成長ホルモ ン、 ヒ トカルシ トニン を初めとする多種多様な生理活性べプチ ドが遺伝子操作によ り作出された各種の細胞より産生されるようになってきた。 これらの中には、 天然に見い出される生理活性ペプチ ド自体 としてだけでなく、 他のタ ンパク質部分が融合したいわゆる 融合ポリ ペプチ ド （または、 キメ ラタ ンパク質ともいう） と して産生されるものも多く存在する。 これらは、 従来のタ ン パク質の分離精製法を用いて精製することも可能であるが、 特に、 融合ポリ ペプチ ドを目的の生理活性ポリ べプチ ド部分 とそれに融合した他のタ ンパク質部分に開裂した後、 目的の 生理活性ボリ ベプチ ドを失活させることな く効率よ く回収す る方法を開発することが望まれていた。 そこで本発明者らは. 上記融合ポリ ベプチ ドの開裂物を特定の P H条件下で処理し、 こう して得られる処理液を逆相系高速液体ク 口マ トグラフィ 一用充塡剤で処理すると効率よ く 目的の生理活性ポリ ベプチ ドが得られるだけでな く、 さ らにこの方法が生理活性ポリ ぺ プチ ド自体を舍有する試料からのそのポリ ぺプチ ドの精製に も有利に使用できることを見い出し本発明を完成した。
    [0010] 従って、 上記目的は、 本発明のポリ ペプチ ドの精製方法で あって、 下記の工程を舍んでなる方法の提供によって達成て きる。 すなわち、 本発明は、
    [0011] ( a ) 粗製ポリ ペプチ ドを含む水性溶液を pH 1 〜 4 の範囲に 調整して夾雑物を沈殿させ、 次いで除まする工程、 ならびに
    [0012] ( ) 前記工程 （ a ) で得た上清を逆相系高速液体ク 口マ ト グラフィー用充塡剤に吸着させ、 次いで目的ポリ ペプチ ドを 溶出する工程、
    [0013] を舍んでなる方法に関する。
    [0014] 〔図面の簡単な説明〕
    [0015] 第 1図 （ a ) 〜 （ e ) は本発明の方法によって精製された ヒ ト カルシ ト ニ ン前駆体溶液の精製工程順による HPLC溶出パ ターンを示す図であり ； 第 2図は第 1図 （ e ) の対象物につ いて、 凍結乾燥後の HPLC溶出パターンを示す図であり ； 第 3 図は、 第 2図の溶液を HPLC分取して得られた高純度精製ヒ ト カルシ トニン前駆体の HPLC溶出パターンを示す図であり ； 第 4図はヒ トカルシ トニ ン融合ポリ ぺプチ ドのイオン交換カラ ムク ロマ トグラフ ィ一による溶出パター ンを示す図であり ； 第 5図は本発明の方法で精製された溶出液の HPLC溶出パター ンを示す図であり ； そして第 6図は本発明の方法で精製され たメ ラ ニ ン細胞剌激ホルモ ン溶出液の HPLC溶出パタ ー ンであ る。 ί発明を実施するための最良の形態〕
    [0016] 本究明の方法によって精製することを目的とするポリ ぺプ チ ドは、 その起源が微生物、 動物もしく は植物細胞のいずれ か、 あるいは所定のポリペプチ ドの生産する目的で遺伝子操 作が施こされたそれらのいずれの細胞に由来するものであつ てもよい。 従って、 本発明の精製方法は上記細胞の処理物 (例えば、 ホモジネー ト ） および/または培養液に向けられ る。
    [0017] これらの処理物およびノまたは培養液は、 本発明の方法に かける前に、 それ自体公知の分離精製法で細胞破砕物または 細胞自体を除去し、 目的とする生理活性ポリ ペプチ ドを水性 媒質中に可溶化し、 さらに必要によりそれらを濃縮しそして 精製する。 生理活性ポリぺプチ ドが上記起源より融合ポリ ぺ プチ ドとして得られる場合には、 融合ポリペプチ ドの状態で かなりの純度まで精製し、 それを生理活性ポリ ぺプチ ド部分 と他のタ ンパク質部分に開裂した後に本発明の方法で処理す る。 従って、 本発明にいう 「粗製ポリペプチ ドを舍む水性溶 液」 は、 各種生理活性ポリ ペプチ ドを舍有する上記起源に由 来する広範な処理液を包含し、 また、 本発明の効果を奏する 限り どの段階の精製工程に適用してもよい。 限定されるもの でないが、 特に本発明の方法を有利に実施できるものとして は、 上記の精製した融合ポリ ぺプチ ドを生理活性ポリ ぺプチ ド部分とそれ以外のタ ンパク質部分に分解した後の反応液を 挙げることができる。
    [0018] 上記細胞の処理物および/または培養液は、 それ自体公知 のポリ ぺプチ ドの生産方法によつて調製することができる。 例えば、 発現ベクターを用いたポリ ぺプチ ドの生産に関す る概要は以下のとおりである。
    [0019] ボリ ペプチ ドをコー ドする遺伝子を発現させる宿主として は、 大腸菌、 枯草蘭、 酵母などの微生物、 昆虫類、 哺乳動物 両生類などに由来する動物細胞、 植物細胞が挙げられる。 発 現べクタ一と しては、 目的とするポリ ペプチ ドを舍む遺伝子 をこれらの細胞中で効率よ く発現できるプラス ミ ドであれば 何でもよい。 例えば、 次に示す成書記載の中から適当に選ぶ こ とができる。
    [0020] ベクタ一 D N A、 第 1刷 （ 1986) 、 榊佳之編、 講談社、 続 生化学実験講座 I、 遺伝子研究法 II、 一組換え D N A技術一 第 7章組換え体の発現、 （1986)、 日本生化学会編、 東京化学 同人 ； Recombinant DNA, Part D , Section H , Vectors for Expression of Cloned Genes , (1987) RayWuおよび Lawrence Grossman編、 Academic Press, INC： Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed, Book 3, (1989) J . Sambrook , E. P. Pri tsch および T, Maniatis編、 Cold Spring Harbor Laboratory Pressなど β
    [0021] 例えば、 大腸菌の場合は、 PMB, pBR, pUC 型ベクターが、 酵母については、 Yip, YRp， YEp 型べクタ一が、 枯草菌につ いては、 pUB, pBC, PBD 型が使用できる。 また、 動物細胞に 関しては、 SV40, B V, BPV型が、 植物細胞に関しては、 大腸 菌の場合と同一ベクターを用いることができるが、 プロモー ターのみ植物で働く ものに変える必要がある。 例えば、 植物 で働く ものとしては、 ク ロ ロフ ィ ル a b ノ ィ ンディ ングプ口 ティ ンのプロモーター、 カ リ フラワーモザィ ク ウ ィ ルス 35S 等が挙げられる。
    [0022] 尚、 これらべクタ一の組換え、 および組換えプラス ミ ドに よる宿主細胞の形質転換、 形質導入は、 それぞれ前述の文献 等に記載されるそれ自体公知の手順によって行う ことができ る。 こう して得られる形質転換される細胞は、 由来する細胞 を増殖するのに通常使用される培地および培養条件下で培養 することができる。
    [0023] このような培養物からのポリ ぺプチ ドおよび または融合 ポリぺプチ ドが細胞外へ分泌される場合には細胞を除去し、 細胞内へ蓄積される場合には培養液を除去した後、 細胞破碎 等でボリ ぺプチ ドおよび Zまたは融合ポリぺプチドを探取す る。
    [0024] 限定されるものでないが、 本発明による精製の対象とされ るポリ ぺプチ ドとは、 ァ ミノ酸が 2個以上べプチ ド結合して いるものをいう。 また、 そのア ミノ酸に糖、 リ ン酸が結合し ていたり、 ポリ べプチ ドの N末端側がァ ミ ド化されている等 の修飾を受けているものも包舍する概念で用いている。 この ようなポリ ペプチ ドとしては、 分子量が 15， 000以下であつて 例えば、 イ ンス リ ン、 成長ホルモ ン放出因子 （GRF)、 上皮細 胞成長因子 （EGF)、 心房性ナ ト リ ゥム利尿べプチ ド （ANP)、 サイ モ シ ン 、 サイ モ シ ン /5 4 、 サイ モポェチ ン、 ト ラ ン スホ一ミ ング成長因子（TGF— a ) 、 副腎皮質刺激ホルモ ン ( ACTH ) 、 カルシ ト ニ ン遺伝子関連ペプチ ド （CGBP ) および 軟骨因子 （CDF)などのホルモ ンもしく は成長因子、 ならびに ィ ンタ一ロ イ キ ン一 2およびィ ンタ一ロ イ キ ン一 3 などのサ ィ トカイ ンが挙げられる。 また、 これら以外のポ リ ペプチ ド で本発明の方法の適用がより好ま しいものには、 以下に列举 するよう なものが舍まれる。
    [0025] なお、 以下のポ リ ペプチ ドの説明において、 ア ミ ノ酸、 そ の他に関して略語を表示する場合は、 IUPACの規定、 あるい は、 当該分野における慣用記号に従う。 その例を次に挙げる,
    [0026] Ser ： L—セ リ ン、 Leu L一 ロ イ シ ン、
    [0027] Arg ： L—ァルギニ ン、 Cys L一 システィ ン
    [0028] Gin ： L一グルタ ミ ン、 Lys Lー リ ジ ン、
    [0029] lie ： L— イ ソ ロ イ シ ン、
    [0030] Pro ： L—プロ リ ン、 Val Lー ノ リ ン、
    [0031] His ： L— ヒ スチジ ン、 Met L一メ チォニ ン
    [0032] Ala ： L—ァ ラニ ン、 Gly グ リ シ ン、
    [0033] Phe ： L— フ エ二ルァ ラ ニ ン、
    [0034] Asp ： Lーァスパラギ ン酸、
    [0035] Asn ： L—ァ ス ノ、'ラギン、
    [0036] Glu ： L一グルタ ミ ン酸、
    [0037] Trp ： L— ト リ ブ トフ ァ ン、
    [0038] Thr ： L—ス レオニ ン、
    [0039] Tyr ： L—チ ロ シ ン、
    [0040] X ： 上記ア ミ ノ酸のいずれか 1 つ、
    [0041] hCT ： ヒ ト カルシ ト ニ ン、
    [0042] CT ： カノレシ ト ニ ン、
    [0043] HPLC ： 高速液体ク 口マ トグラフィー
    [0044] ( 1 ) 血管収縮または血圧上昇薬と して使用できるア ンジォ テ ンシ ン D (ゥマ由来）
    [0045] Asp- Arg-Val-Tyr - 1 le-His-Pro-Phe
    [0046] (L.T.Skeggs 等、 J.Exptl.Hed: 106, 439, 1957)
    [0047] ( 2 ) 血圧降下剤と して知られているア ンジォテ ン シ ン D拮 抗剤
    [0048] Ser-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Ala
    [0049] ( 3 ) ア ンジォテ ンシ ン IE
    [0050] Arg- Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe
    [0051] (Campbell. W.B.等、 Science, 184, 994, 1974)
    [0052] ( 4 ) 高カルシゥム血症治療薬として知られるカルシ トニ ン の C末端グリ シ ン付加体 （ C末端アミ ド化のための前駆体） ( ヒ ト ）
    [0053] I I
    [0054] Cys— Gly— Asn し eu— Ser - Thr— Cys— Met し eu—
    [0055] Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-
    [0056] Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-
    [0057] Gly-Val-Gly-Ala-Pro-Gly
    [0058] (ブタ）
    [0059] Cys - Ser - Asn -し eu - Ser - Thr - Cys - Val-Leu- Ser- la-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn- Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gl -Met-Gl -Phe- Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-Gly
    [0060] (ゥ シ）
    [0061] Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu- Ser-Ala-I'yr-Trp-Lys-Asp-Leu-Asn-Asn- Tyr-His-Arg-Phe-Ser-Gl -Met-Gly-Phe- Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-Gly
    [0062] (サケ ）
    [0063] Cys- Ser - Asn - Leu - Ser - Thr - Cys - Val -し eu- uly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys- Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr- Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-Gly
    [0064] ( ゥ ナギ）
    [0065] Cys— Ser - Asn -し eu— Ser - Thr— Cys - Val -し eu - Gly -し ys し eu - Ser— Gin - Glu -し eu - His-Lys - Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val- Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Gly
    [0066] ( 卜 ひ ）
    [0067] Cys-Ala-Ser-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu- Gly-し ys -し eu - Ser-Gln - Glu - Leu - His -し ys - Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-As -Val - Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Gly
    [0068] (Lasmoles. F. 等、 FEBS lett.180, 113, 1985)
    [0069] ( 5 ) メ ラ二ン細胞刺激作用を持つメ ラ二ン細胞刺激ホルモ ン、 — MSH
    [0070] Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp- Gly-Lys-Pro-Val
    [0071] (Harris, J. I . 等、 Nature, 179= 1346, 1957)
    [0072] ( 6 ) メ ラ ニ ン細胞剌激ホルモ ン、 /5 — MSH (ッノ ザメ ） Asp-Gly-Asp-Asp-Tyr-Lys-Phe-Gly-His- Phe-Arg-Trp-Ser-Val-Pro-Leu (Bennet, H.P.J.等、 B i ochem . J . , 141, 439, 1974)
    [0073] ( 7 ) ト リ プシ ンイ ンヒ ビター
    [0074] ( ヒ 卜 ）
    [0075] Asp-Ser-Leu-Gly-Arg-Glu-Ala-Lys-Cys- fyr-Asn-Glu-Leu-Asn-Gly-Cys-Thr-Lys- I le-Tyr-Asn-Pro- Val-Cys-Gly- Thr- Asp- Gl -Asp-Thr-Tyr-Pro-Asn-Gly-Cys-Val- し eu - Cys - Phe— blu - Asn - Arg—し ys - Arg - Gin - Thr - Ser- lie -し eu- Ile-Gln- Lys-Ser-Gly- Pro-Cys
    [0076] (Bartelt.D.C.^. Arch . Bi ochem . Biophys . , 179, 189, 1977) (ゥ シ）
    [0077] Asn-Ile-Leu-Gly-Arg-Glu-Ala-Lys-Cys- Thr- Asn - Glu - Va卜 Asn - Gly - Cys - Pro - Arg - I le-Tyr-Asn-Pro- Val-Cys-Gly- Thr- Asp- Gly-Val-Thr-Tyr-Ser-Asn-Glu-Cys-Leu- Leu-Cys-Met-Glu-Asn-Lys-Glu-Arg-Gln- Thr-Pro-V -Leu-Ile-Gln-Lys-Ser-Gl
    [0078] Pro-Cys
    [0079] (Greene, し丄等ヽ J. Biol . Chem.244, 2646, 1969)
    [0080] ( 8 ) カルシウム放出作用のある副甲状腺ホルモ ン
    [0081] (ブタ）
    [0082] Ser - Vs Ser - Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His- Asn—teu—Gly—Lys—His—Leu—Ser—Ser—leu- Glu - Arg - Val— ϋΐπ - Trp -し eu - Arg -し ys -し ys- Leu -Gin-Asp- Val-His-Asn- Phe-Val-Ala- Leu-Gly-Ala-Ser-Ile-Val-His-Arg-Asp- Gly-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys- Glu - Asp - ASn - Val -し eu - Va卜 Glu-Ser - His- Gln - Lys- Ser - Leu - Gly- Glu - Ala - Asp-し ys- Ala - Ala - Val - Asp - Val -し eu-Ile - Lys- Ala - Lys-Pro-Gln
    [0083] (Brewer, H.B. 等、 Amer.J.Med. , 56, 759> 1974)
    [0084] ( 9 ) 回避行動誘起下垂体べプチ ド
    [0085] (ブ^ J
    [0086] Cys - Tyr - Phe - Gin - Asn - Cys - Pro -し ys
    [0087] (Lande, S. , 等、 J . B i o 1. Chem . , 246, 2058, 1971)
    [0088] (10) プロイ ン シュ リ ン Cペプチ ド
    [0089] ( ゥ シ）
    [0090] Glu-Val-Glu-Gly-Pro-Gln-Val-Gl -Ala- Leu-Glu-Leu-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala- Gl -Gly-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln
    [0091] (Salokangas, Α·等、 Eur . J . B i ochem . , 20, 183, 1971)
    [0092] (11) 細胞成長促進因子として知られるィ ン シユ リ ン様成長 因子 I
    [0093] Gly-Pro— Glu— Thr—し eu— Cys Liし y - Ala-Glu- Leu-Val-Asp-Ala-Leu-Gln-Phe-Val-C s- Gl -Asp-Arg-Gl -Phe-Tyr-Phe- Asn-L s- Pro-Thr-Gl -Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg- Arg-Ala-Pro-Gln-Thr-Gl - I le-Val -Asp- Glu-Cys-Cys-Phe-Arg-Ser-Cys-Asp-Leu- Arg-Arg-Leu-Glu- et-Tyr-Cys-Ala-Pro- し eu-Lys-Pro - Ala - Lys - Ser- Ala
    [0094] (Rinderknecht, 等、 Proc . Na 11. Acad . Sc i . USA , 73s 4379, 1976)
    [0095] (12) 脬臓ポリベプチ ド
    [0096] ( 卜 リ ）
    [0097] Gl -Pro-Ser-Gln-Pro-Thr-Tyr-Pro-Gl -
    [0098] Asp-Asp-Ala-Pro-Val-Glu-Asp-Leu-Ile-
    [0099] Arg-Phe-Tyr-Asp-Asn-Leu-Gln-Gln-Tyr-
    [0100] Leu-Asn-Val-Val-Thr- Arg-His-Arg-Tyr
    [0101] (Kimmel, J.R.等、 J . B i o 1. Chem . , 250, 9369, 1978) 従って、 本発明の融合ポリぺプチ ドは、 上記生理活性ボリ ペプチ ドをコー ドする遺伝子を適当な宿主細胞中で発現させ た場合、 例えばそれらを検出しやすくするようなタ ンパク質 (必要により適当な開裂可能部位を舍む） をコー ドする遺伝 子と上記遺伝子とを人工的につなげた遺伝子の生産物である, このよう なタ ンパク質としては、 ^ —ガラク ト シダ一ゼ、 ク 口ラムフ エニコールァセチル ト ラ ンスフヱラ一ゼなどが挙げ られる。
    [0102] 以上のようにして調製した粗製ポリ ぺプチ ドを舍む水性溶 液は、 R I A法および HPLC法などを用いて目的とするポリ ベ プチ ドを追跡しながら本発明の方法を行うのが好ま しい。 な お、 融合ポリ ぺプチ ドが目的のポリ ぺプチ ドの前駆体として 得られる場合には、 上述のように目的のポリ ペプチ ド部分と それに融合した他のタ ンパク質部分を開裂して本発明の粗製 ポリ ぺプチ ドを舍む水性溶液を調製する必要がある。 この開 裂手段は、 融合ポリ ぺプチ ドのタィ プに応じて選ぶこ とがで きるが、 一般的に、 CNBr、 ト リ プシン、 コ ラゲナーゼなどで 処理する方法がと られる。 このとき、 非特異的ぺプチダーゼ 活性を胆害するために、 適当量のプロテア一ゼ阻害剤、 例え ば、 N —ェチルマレイ ミ ド（NEM) 、 ジチオスレィ トール（DTT) 2 —メ ノレカプ トエタノ ール （ 2 — ME) 、 エチレンジァ ミ ン四 酢酸（EDTA)、 フヱニルメ タ ンスルホニルフルオ リ ド（PMSF)等 を添加する こ とが好ま しい。
    [0103] 反応生成物、 すなわち、 本発明の粗製ポリ ペプチ ドを舍む 水性溶液は、 次いで本発明の精製工程にて精製される。 例え ば、 コ ラゲナ一ゼ切断により得られる粗製ポリ ペプチ ドの反 応溶液中に、 ギ酸、 酢酸、 塩酸等の酸またはこれら酸水溶液 を加えて、 pH 1 〜 4、 好ま し く は pH 2前後に調整する。 PHが 4 を超える と、 内在性プロテアーゼまたはコ ラゲナーゼ中に 混在する可能性のある非特異的なプロテアーゼが作用し、 目 的とする生理活性ポリ べプチ ドの安定性を害するばかり力、、 除去すべき夾雑物が十分変性せず沈澱しないおそれがある。 また PH 1 未満である と目的とするポリ ペプチ ドの沈澱 G おそ れがあり、 画収率が悪く なる。 また、 酸と してはギ酸が最も 望ま しい。 こ う して沈殿する夾雑物は、 濾過または遠心分離 にかけられる。 例えば、 この液を静置した後、 遠心分離によ り沈澱した夾雑物を分離して、 目的とするポリ ぺプチ ドが溶 解している上清を得る。 この時の遠心分離の画転数は 1000〜 100000回転、 好ま しく は、 5000〜 30000 回転で行うのがよい。
    [0104] 1000面転以下で行う と夾雑物が十分除去できないおそれが あり、 100000回転以上では、 効果にかわりがない。
    [0105] 上記工程は、 室温、 あるいは室温以下で行うのがよ く 、 特 に 1〜15てで行うのがよい。 0 'C以下になると溶液が凍結し てしまい、 再融解する際、 ポリ ペプチ ドの安定性が悪く なる おそれがある。 また 15てを超えると、 目的とするポリぺプチ ドの安定性が悪く なるおそれがある。 酸による処理時間は数 分〜数時間であるが、 通常 30分程度で十分な効果が得られる c 数分以下の場合では夾雑物の十分な除去が得られない恐れが あり、 数時藺以上では効果にかわりがない。
    [0106] 次に、 上記工程で得られた目的とするポリ ベプチ ドが溶解 している酸溶液を、 逆相系高速液体ク ロマ トグラフィー用充 塡剤に吸着させる。 吸着方法としては、 担体と溶液中のポリ ぺプチ ドが接触できる方法ならいずれの方法でもよ く、 例え ばポリ ペプチ ドが溶解している溶液中に適量の担体を入れ、 攪拌または振盪することにより接触を促進し、 吸着させる方 法、 適当な材質のチューブに担体を充填し、 ポリ ペプチ ド溶 液を通過させ吸着させる方法、 担体を濾過床とし、 ポリ ぺブ チ ド溶液をその上に注ぎ吸引することにより通過、 吸着させ る方法等があるが、 ペプチ ドが担体と接触し、 吸着させる方 法であれば特に限定されるものではない。
    [0107] ポリ ペプチ ドを吸着する逆相系高速液体ク ロマ ト グラ フ 一用充塡剤としては表面に種々の炭素数の置換基を有するシ ァノ ール基が結合したものを用いることができ、 市販品とし ては、 例えばカプセルパック C, BSG300、 カプセルパッ ク
    [0108] C8SG300 、 カプセルパッ ク C, 8AG120、 カプセルパッ ク C8AG120 (いずれも㈱資生堂製） 、 スーパーパッ クスフユ リ ソープ 0DS 2 ( フ ァ ノレマ シア社製） 、 TSKgel ODS-80TM, TSKgel
    [0109] 0DS-120A, TSKgel ODS- 120T (いずれも東ソ一株式会社製） 、 ハイ 'ポア一 RP-304C4、 ハイ ボア一! P-318 8 (バイ オラ · ト · ラボラ ト リ 一社製） 等がある。
    [0110] 吸着したポリ ぺプチ ドの溶出は、 0. 1 % ト リ フルォ口酢酸 (ア ミ ノ酸分折用） 水溶液で洗浄した後、 ァセ ト ニ ト リ ル、 メ タノ ール、 ブタノ ール等の極性溶媒で極性を変える こ とに より行う こ とができる。
    [0111] 〔実施例〕
    [0112] 次に実施例によって本発明を更に詳細に説明する。 なお、 本発明はこれによって限定される ものではない。
    [0113] 例 ： 形質転換大腸菌により生産される ヒ トカルシ トニン前駆 体の精製
    [0114] 融合ポリ ぺプチ ドの製造 (参考例）
    [0115] ヒ ト カルシ ト ニ ン前駆体 （ C末端をア ミ ド化してヒ ト カル シ トニンとする） を得るためにヒ トカルシ トニ ンーコ ラゲナ ーゼ切断部位べプチ ドー ーガラク ト シダ一ゼ融合ポリ ぺプ チ ドをコー ドする遺伝子を作製し、 大腸菌に組み込み発現さ せた。 この形質転換微生物を後記の寸法で培養した。
    [0116] すなわち、 プラス ミ ド PZT32 (特願昭 63— 226288号） で形質 転換した大腸菌 Μ 15株を、 30 £ ジヤーフ ァ ーメ ンター （㈱日 立製作所製、 HMF-30A)を用いて 20 £培養した。
    [0117] 培地は、 以下に示したものを使用した。
    [0118] NazHP04 · 12H20 1. 8 %
    [0119] KH2P04 0. 2 %
    [0120] (NH4) 2S04 0. 2 %
    [0121] 酵母エキス 0. 5 %
    [0122] ノ ク ト ペプ ト ン（Difco) 0. 5 %
    [0123] MgS04 · 7 HzO 0.01%
    [0124] ブドウ糖 0. 5 %
    [0125] ア ンピシ リ ン 150/«ノ^
    [0126] ア ンビシ リ ン 150 / fflgを舍む L B培地（T . Man i a t i s et al. ； Molecular Cloning p48 (1982))で 30· (：、 1晩の前培養 をした菌液 500 を前記の培地に植菌して、 30'Cで培養した。
    [0127] 1 vvm で空気を通気し、 苛性ソーダで培地 pHを 7. 0 に調整し ながら培養を続けた。 3時間培養して 0D66。 = 1 となったと きに、 1 PTG を I mM濃度で添加した。 さらに、 6時間培養を 続け、 OD 660 力、' 10に達したところで遠心分離により集菌した c 滅菌水で洗浄した後、 菌体を 10mMト リ ス塩酸 （PH 8. 0 ) - 1 mM EDTA — 0. 1 mM DTTに懸濁し、 10 'Cでホモジナイザー
    [0128] (ゴゥ リ ン社製） を用いて菌体を破砕した。 遠心分離によ り 得られた上清を細胞抽出液とした。
    [0129] ^ —ガラ ク ト シダーゼ活性を指標として、 ヒ ト カルシ ト ニ ン融合ポリ ぺプチ ドの精製を行った。
    [0130] まず、 ミ リ ボア社製のタイ プ P Tフ ィ ルタ （分画分子量 3C' 万） を用いた限外濾過 （商品名 ： ペリ カ ンカセ ッ ト ） によ り 低分子量の蛋白質等を除まし、 さ らに DEAE— ト ョパール 650C (東ソ一株式会社製） を用いたィォン交換力ラムク ロマ トグ ラフィ 一により精製した。 溶出緩衝液は lOmMト リ ス塩酸緩衝 液 （ PH 7. 4 ) _ 0. 1 mM EDTA 一 0. 1 mM MDTT を用いた。 非吸 着蛋白質が溶出した時 （ 1000 ) 、 塩化ナ ト リ ゥムで段階的 に濃度勾配をかけて吸着蛋白質を溶出させた。 この時の塩化 ナ ト リ ウム濃度は、 0.16M, 0.32M, 0. 8 Mである。 溶出パ ターンを第 4図に示す。 図中、 塩化ナ ト リ ウムの濃度を ——- で示す。 第 4図では、 ミ ラーの方法（Miller. J. , Experiments in molecular genetics 352 〜 355 (1972) )で測定した ーガ ラク ト シダーゼ活性を で、 また 280nmの吸光度で測定し た蛋白量を -…で示した。 0.32 M塩化ナ ト リ ゥム溶出画分の 18 00〜4500flz£に活性のピークが認められた。 そこで、 この溶出 画分を精製蛋白質分画とした。 蛋白質量は、 ローリ ー法
    [0131] (Lowry, O.H.et al. , J . Β i ο 1. Chem . , 193, 265(1951)) で 測定した。 ローリ一法の検量線はゥ シ血清アルブミ ン （ シグ マ社製、 フラク ショ ン V ) を用いて作製した。
    [0132] 尚、 ここで ^—ガラク ト シダーゼ 1 Un i tは、 pH 7. 0、 28て 条件下で o —二 ト ロフヱノ 一ル ^ ー Dガラク ト シ ドに作用し、 1分間に l nmole の o —二 ト ロフヱニルを遊離する力価と定 義した。
    [0133] 以上の処理による比活性の挙動を第 1表に示す。 精製工程 全
    [0134]
    [0135] 細胞抽出液 42200 63500 100 限外濾過 22800 76900 65
    [0136] DEAE- 卜 3パール 9100 222000 39
    [0137] 650C 精製により比活性は約 3. 5倍に上昇し、 222, 000 U Zing 蛋白質となった。
    [0138] 融_合ポリ ぺプチ ドの特—異的^解による粗製ポリ ぺプチ ドの調 上記で精製したヒ ト カルシ トニ ン—コラゲナ一ゼ切断部位 ぺプチ ドー ^ —ガラク トシダ一ゼ融合ポリ ぺプチ ドをコラゲ ナ一ゼを用いて特異的に分解し、 ヒ ト カルシ ト ニ ン C末端グ リ シン付加体を得た。 コラゲナ一ゼはシグマ社製 （タィ プ VI ) を用いた。 反応液組成を以下に示した。
    [0139] 5 mM 塩化カルシウム
    [0140] 50mM ト リス塩酸緩衝液 PH7. 5
    [0141] 250/ίΜ 塩化亜鉛
    [0142] 10mM ジチオス レィ トール
    [0143] lOmM 2 —メ ルカプ トエタノール
    [0144] 1 mg/ 融合蛋白質精製標品
    [0145] 100ユニッ トノ Eg コ ラゲナーゼ
    [0146] 酵素反応を 37てで 3時間行い、 HPLCによ り反応生成物を確 認した。 この反応液を粗製ボリ ぺプチ ド舍有水性溶液とした。 なお、 HPLCの分折条件は次の通りである。
    [0147] カ ラムに力プセルパック CBSG300 ( 6 mm * X35譲）（㈱資生堂 製） を用い、 溶出溶媒を 0. 1 % ト リ フルォ ロ酢酸水溶液一
    [0148] 0.085% ト リ フルォ口酢酸ァセ トニ ト リル溶液とし、 流速 1. 5 /min で 0.085% ト リ フルォ口酢酸ァセ トニ ト リ ル溶 液の濃度を 20分間で 60%にまで直線的に上げることにより、 ァセ トニ ト リル濃度が約 40%でカルシ ト二ン前駆体が溶出す る。 この時の検出波長は UV 214nmである。
    [0149] 例 1 ： 粗製ポリベプチ ドの精製
    [0150] 上記の粗製ポリ ぺプチ ド舍有反応液にギ酸を 2 %になるよ うに添加し、 攪拌後、 30分間、 4てで静置した。 ここで十分 に夾雑物が沈澱しているのを確認した後、 遠心分離（12000rpm XlOmin)し、 上清を得た。 この時の上清の HPLC溶出パターン を第 1図 （ a ) に示す。 この上清を磁製ブッ フナ一漏斗に濾 紙 （㈱東洋濾紙製 No.2 ) を敷き、 その上に濾過床としてカブ セルパック C8SG300 粉末 （㈱資生堂製） 10 gを敷き吸引瓶に 取り付け、 吸引しながら静かに上記上清をブッフナー漏斗内 に注いだ。 この時の非吸着画分の HPLC溶出パター ンを第 1図
    [0151] ( b ) に示す。 吸引し終った後、 0. 1 % ト リ フルォロ酢酸 (和光純薬株式会社製、 ア ミノ酸分折用） 水溶液 50 を 2 回 に分け洗浄した。 次に、 0. 1 % ト リ フルォロ酢酸/ 10%ァセ トニ ト リル水溶液 50 を 2回に分け洗浄した （溶出液の HPLC 溶出パター ン ； 第 1.図 （ c ) )。 次いで、 0. 1 % ト リ フルォロ 酢酸/ 20%ァセ トニ ト リ ル水溶液 50m£を 2回に分け洗浄を行 つた。 （溶出液の HPLC溶出パターン ； 第 1図 （ d ))。 その後.、 0. 1 % ト リ フルォ ロ酢酸/ /60%ァセ ト ニ ト リ ル水溶液 5威を 10回に分け、 目的とするポリ ぺプチ ドを溶出させ （溶出液の HPLC溶出パタ一 ン ； 第 1図 （ e ))、 最後にメ タノ ール （HPLC 分折用 ； ナカライ テスク株式会社製） で吸着物を完全に溶出 させた。 この精製結果を第 2表に示す。 純度は、 溶液中の全 蛋白質中のヒ ト カルシ トニン前駆体の重量％である。 ギ酸処 理後の純度に関しては、 第 2図の I , Eのビークの和より箕 出した。 コ ラゲナーゼ反応後のギ酸処理により純度が 56倍上 昇し、 100%のヒ トカルシ トニン前駆体が画収できる。 また 次の力プセルパック C8SG300 処理によつても更に純度が 70% 以上に上昇し、 収率が 97%であった。
    [0152] 第 2 表 精製工程 ヒ トカルシ ト -ン 純 度 収 率 前駆体 （mg) (%) (%) コラゲナーゼ切断 120 0.9 100 ギ酸処理 120 51 100 カプセルパッ ク 115 >70 97 C8SG300 処理 第 2図は、 第 1図 （ e ) に相当する溶出物を凍結乾燥後、 HPLC分折を行った時の溶出パター ンを示す図である。 同図か らわかるように、 HPLC分圻の溶出パターンで目的のポリ ぺプ チ ドのピークが大き く 4本存在するが、 これは、 コ ラゲナー ゼ反応中に、 N未端部分が変化したものである。 それぞれの ピーク は、 ペプチ ドシーケ ンサー （ A B 1 社製 471型） の分 析により、 I , Π のピークは、 1 〜33のア ミ ノ酸を有する ヒ トカルシ トニン前駆体であり、 1Πのピークは N末端の 1〜 7 位が欠除したもの、 IVのピークは N末端の 1〜 8位が欠除し たものであることがわかった。 尚、 Uのピークは 1位と 7位 のシスティ ンの S — S結合が還元されたものであった。
    [0153] 本発明法による精製法に更に HPLC分取操作を行った後の分 圻結果を第 3図に示す。
    [0154] 一方、 比較例として、 上記の粗製ポリペプチ ド舍有反応液 を用い、 従来のィォン交換力ラムおよび H PLCによりポリ ぺプ チ ドの精製を行った場合、 工程数は 10段階を要した。 また所 要時間は 1 回の工程につき 2時間を要し、 全体で本例 1 の 10 倍を要した。
    [0155] 例 2および 3
    [0156] 上記参考例で示したヒ トカルシ トニンをコー ドする遺伝子 の大腸菌による発現、 精製操作に準じてァンジォテ ン シ ン D — コラゲナーゼ切断部ぺプチ ドー 5—ガラク ト シダ一ゼ融合 ポリ べプチ ドおよびメ ラ ニ ン細胞刺激ホルモ ンーコ ラゲナ一 ゼ切断部位ペプチ ド一 / 一ガラク ト シダ一ゼ融合ポリ ベプチ ドを生産し、 それぞれに由来粗製ポリ ぺプチ ド舍有水性溶液 を調製し、 例 1 と同様に処理した。 ア ンジォテ ン シ ン Πおよ びメ ラ ニ ン細胞剌激ホルモ ンに対する、 それぞれの溶出液の H PLC溶出パター ンを第 5図および第 6図に示す。
    [0157] 〔産業上の利用可能性〕
    [0158] 本発明の方法は、 各種のポリ ペプチ ド、 特に生理活性ポリ ぺプチ ド製造業におけるそれらの精製工程で有利にできる。
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲
    1. ( a ) 粗製ポリ ペプチ ドを舍む水性溶液を pH 1〜 4の 範囲に調整して夾雑物を沈殿させ、 次いで除去する工程、 な らびに （ b ) 前記工程 （ a ) で得た上清を逆相系高速液体ク 口マ トグラフィ一用充塡剤に吸着させ、 次いで目的ボリぺプ チ ドを溶出する工程、
    を舍んでなるポリ ぺプチ ドの精製方法。
    2. 粗製ポリペプチ ドが融合ポリ ペプチ ドを目的の生理活 性ポリ ベプチ ド部分とそれに融合した他のタンバク質部分と に開裂したものである請求項 1記載の方法。
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    公开号 | 公开日
    CA2057014A1|1991-10-01|
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    EP0480048B1|1997-02-05|
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    JP2/86898||1990-03-30||
    JP21301690||1990-08-10||
    JP2/213016||1990-08-10||US07/776,272| US5612454A|1990-03-30|1991-03-29|Process for purification of polypeptide using a buchner funnel|
    EP91906510A| EP0480048B1|1990-03-30|1991-03-29|Process for purifying polypeptide|
    CA 2057014| CA2057014C|1990-03-30|1991-03-29|Process for purification of polypeptide|
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